糖化血红蛋白HbA1 c的构成

 ● 糖化血红蛋白(Hemoglobin， Hb) 是指血糖和红细胞中的血红蛋白之间形成的非酶促的蛋白糖化反应物。

 ●总血红蛋白可以分为A，A2，F三种组分，其中F主要在胎儿期，而成人主要为A，是由两个a链和两个β链构成。A2由两个a链和两个δ链形成，F由两个a链和两个y链形成。

●成人HbA占97%， 又可分为HbA0和HbA1两种，HbA0为没有被糖基化部分，而HbA1为被糖基化部分。

●正常人维持一定的血糖水平，即会形成正常范围内的HbA1,其中HbA1c为主要组分，HbA1a和HbA1b的 含量则非常低。所以在反映血糖水平时主要用HbA1c来表示。

 ●正常人平均HbA1c水 平约为5%。总HbA1约占6%左右，而HbA1a和HbA1b总和尚低于1%。

糖化血红蛋白HPLC检测方法

● 目前HPLC法测定HbA1c使其重复性得到很大的提高。

●美国临床化学协(AACC)糖化血红蛋白标准化分会和IFCCHbA1C标准化工作组建议，以DCCT研究中所"指定的方法”-HPLC方法作为检测糖化血红蛋白的标准，希望以此使大多数的实验方法能够参照“指定的方法”实现标准化。

●1993年美国1型糖尿病控制及并发症实验( DCCT)和英国大规模的2型糖尿病控制与并发症关系研究(UKPDS)的研究中把HbA1c作为糖尿病控制的一-个观察指标。

●1996年4月起在日本，HbA1c被纳入老年人保健法中糖尿病筛选的检查项目。

●2002年美国糖尿病协会(ADA)已将其作为监测糖尿病控制的标准对其应用也作了明确的规定:即所有糖尿病患者均应常规测定HbA1c。其初诊时测定结果为基线时的代谢状况，此后的测定值则作为糖尿病长期治疗控制中的一部分， 这样在提高糖尿病诊断水平、血糖控制、慢性并发症的防治中具有十分重要的应用价值

填料描述
Target-Gly填料基质为聚甲基丙烯酸酯（PMMA）。运用特殊的化学键合技术， 将离子交换功能基团均匀细密地键合在聚合物亲水层的表面。

填料稳定性
由于 PMMA的表面修饰是基于化学键键合，所以Target-Gly离子交换填料具有良好的稳定性。 该固定相能够与大多数缓冲液如醋酸铵、磷酸盐、Tris 等相容。在 pH 6.0时以 20mM磷酸盐缓冲溶液为流动相运行Target-Gly色谱柱，柱效几乎没有变化。

流动相兼容性
与水溶液，水与乙腈、丙酮或甲醇的混合物等相容。典型的缓冲液包括磷酸盐、Tris和醋酸盐等。

流速
内径为3.0-4.6mm的色谱柱典型操作流速为0.40-1.0mL/min。

样品与流动相
       为了避免色谱柱的堵塞，所有样品和溶剂，包括缓冲溶液在内，都必须在使用前用0.45m或0.22m 的滤膜 过滤。 建议使用预柱滤片（0.5m孔径）或保护柱来保护色谱柱。Target-Gly 色谱柱可以使用水溶液， 或者有机溶剂(如甲醇、乙腈）与水的混合物等来作为流动相。典型的流动相中含有磷酸、醋酸或 Tris 的钠盐或钾盐。 流动相在使用 前需要脱气。一个简单的脱气方法是将流动相在由水泵形成的真空下超声 5min。

色谱柱的使用
1）新的Target-Gly 色谱柱的运输溶剂是 20mM 磷酸盐缓冲液（pH 6.0)。初次使用时，建议用 10-20 倍柱体积的运输溶剂进行冲洗以活化色谱柱。 接着可用用户自己选择的流动相冲洗色谱柱 进行平衡。 流速由0.1mL/min 逐渐升至所需的操作条件，直至基线稳定为止。 如果柱压和基线波动较大，这可能是气泡进入了色谱柱中。这时可用较高流速冲洗色谱柱 3-10 分钟，例如 4.0*33mm的色谱柱可采用流速 1.5-2.0mL/min。 如果流动相的类型或 pH与色谱柱中的储存溶剂差异较大，建议将色谱柱先用新的流动相冲洗 10 倍柱体积。
2）为了获得较好的分离效果和延长柱的使用寿命， 请尽量使用 pH 在 2-10 范围内的流动相。
3）正常的操作压力应当低于3,500psi
4）耐受温度为 80℃。为了延长柱的使用寿命，请尽量在60℃范围内操作。
5）长期不用时，Target-Gly色谱柱应保存在含 0.1%NaN3 的 20mM 磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中。色谱柱需要用储存缓冲溶液冲洗至少20倍柱体积。然后再用随色谱柱附上的两个可拆卸的堵头塞紧色谱柱的两端以防止柱床的干涸。

色谱柱的清洗

 在使用过程中，样品经常会被吸附在柱入口端的筛板或者填料上。当样品吸附累积到一定程度时，柱压将会升高，色谱峰形也会出现展宽。下面是色谱柱清洗的基本步骤：
1）将色谱柱与检测器断开；
2）将色谱柱反接后进行冲洗；
3）将流速设置到所推荐的流速的 50%进行冲洗。注意柱压的变化。如果柱压超出正常水平许多， 则需要降低流速， 或选用低粘度的清洗溶液；
4）通常 10-15倍柱体积的清洗溶液。低 pH 的盐溶液有助于去除碱性蛋白。 高 pH的盐溶液有助于去除酸性蛋白。 有机溶剂可去除疏水蛋白。Target-Gly色谱柱清洗溶液为含 1.0M NaCl pH10的50mM 磷酸盐缓冲液.

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