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亲和色谱柱

亲和色谱柱

发布时间: 2016-09-27 21:39 

                ProAqa亲和色谱柱是设计用于HPLC和FPLC系统的高流速高压色谱柱。其固定相采用平均粒径为20 µm的多孔聚乙烯二乙烯基苯(PS/DVB)为基质,表面键合一层亲水涂层,涂层上以化学键合的方式连接了蛋白质A,蛋白质A可结合除IgG3之外的含Fc片段的免疫球蛋白。该色谱柱可用于抗体和融合蛋白(可特异性结合重组蛋白A)的定量和小规模纯化。
 亲和色谱柱


Figure 1.抗体样品在ProAqa 2.1×30 mm柱上的穿透曲线(Mab 321 from Sepax Technologies, Inc.) 。

流动相:磷酸钠缓冲溶液,0.1M, pH 7.4, NaCl, 0.15M, 0.15mg/mL Mab 321;

流速:2.0 mL/min;

检测波长:280nm


技术参数

项目

详细信息

基质

交联聚苯乙烯二乙烯基苯

固定配体

重组蛋白A

动态结合载量

9.3 mg/ml (DBC曲线见Fig. 1 )

运输溶液

0.1 M 磷酸钠,pH 7,0.02% 叠氮化钠

压力限

180 bar

操作流速

5000 cm/hour

pH范围

2-10

离子强度

0-5 M,所有常见盐

缓冲液

常见缓冲液,包括4 M 尿素,3 M盐酸胍,乙二醇以及一些变性剂

溶剂



水,0–90%乙醇,乙腈以及一些常见有机溶剂。

注: 不可含有可降解和破坏蛋白质A的组分。

操作温度

2-40 °C, 不可冷冻



空白运行

   必须使用高纯度的缓冲盐,并在使用前过滤(0.22 or 0.45 μm)所有的缓冲溶液。

   上样前,必须执行空白运行,并监测本底。为了减小结合和洗脱缓冲溶液之间变化产生的基线变化,建议使用:    

(a) 50 mM磷酸盐 pH 7, 0.15 M NaCl 作为起始/淋洗缓冲溶液,以及

(b) 0.1% (12 mM) HCl 0.15 M NaCl 作为洗脱缓冲液。

   以上是有效的淋洗/洗脱系统,产生的基线波动小。如果要求洗脱样品保留生物活性,不建议使用盐酸(HCl),因为盐酸会使抗体变性。


样品的准备和上样

   为了确保样品的有效结合和避免色谱柱筛板被污染,一般按照以下方式来准备样品:

(a) 将样品溶解到或溶剂替换为起始/淋洗缓冲液,这对于大体积样品尤为重要(超过25%的柱体积)。

(b) 进样前离心或过滤样品 (0.22 或0.45 μm)。

(c) 对血清样品进行热处理(置于56 °C 下30分钟)以去除会堵塞色谱柱的纤维蛋白原。

(d) 对样品进行去脂处理,因为脂类会对色谱柱产生不可逆的污染。

(e) 所有样品使用前应该用0.45 μm或0.2 μm滤膜过滤。

   为了确保样品的有效结合和避免填料与色谱柱被污染,需要对样品载量进行测定:

(a) ProAqa 动态结合载量见“描述”。

(b) 其它抗体的结合载量取决于抗体来源与所属子类以及所使用的配体。但是一般会低于“描述”中IgG的载量。

(c) 当作为分析用途时,可通过标准线性曲线测定小和大上样量。


起始/淋洗缓冲液

(a) 绝大多数情况下,使用简单的缓冲盐如10 ~ 50 mM 磷酸盐或Tris。

(b) 起始/淋洗缓冲液的pH范围可在6.0到9.0之间,但需注意当pH高的时候结合力强。

(c) 加入一些盐 (0.1到0.2 M 的NaCl或KCl) 以防止因蛋白/蛋白相互作用引起的非特异性吸附。


洗脱条件

   如果色谱柱作为分析用途,洗脱缓冲液为含25-100 mM 磷酸盐,pH为 2.0-3.5,含0-150 mM氯化钠的溶液。其它可能会用到的洗脱缓冲盐组分包括盐酸、甘氨酸、柠檬酸、乙酸或其它可调低pH的组分。

   如果色谱柱作为制备用途,可采用以下条件。

(a) 对于绝大多数抗体的洗脱,可将pH降至2-3,常用缓冲体系包括磷酸盐、乙酸盐、盐酸和甘氨酸。根据缓冲体系的不同,缓冲盐浓度为6-100 mM或2-20% (v/v)。

(b) 可用含0.15 M NaCl的6-12 mM HCl来获得理想的pH范围,并将基线波动降到低程度。

(c) 由于抗体会因其种类和所属子类的不同而表现出不同的结合/洗脱行为,优良的洗脱条件需要通过经验性地测定。


例1 单克隆抗体在ProAqa色谱柱上的洗脱

色谱柱



流动相: Buffer A: 0.1M PBS, 0.15M NaCl, pH 7.4

             Buffer B: 0.1M Gly-HCl, pH 2.5

梯度: 0-0.8min, 100%A, 0.8-0.9 min, 0-100%B, 0.9 to 5 min, 100%B, 5.0-5.1min, 100 - 0%B, 5.1-10min, 100%A

流速: 2 mL/min.  检测波长: 280nm

样品:  MAB321 (5mg/ml).  色谱柱规格, 2.1 x 30 mm

订购信息:


产品描述

规格 (ID×Length) (mm)

柱体积(mL)

订货号

ProAqa (不锈钢)

2.1 x 30

0.1

512001-2103

ProAqa (PEEK)

4.6 x 50

0.8

512001P-4605

ProAqa (PEEK)

4.6 x 100

1.7

512001P-4610

ProAqa (PEEK)

10 x 100

7.9

512001P-10010


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