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做开发如何选择色谱柱?

发布时间: 2019-01-17 10:17   772 次浏览

做方法开发的小伙伴们经常会遇到这样的情况,我们拿到一个样品后,得知了样品的部分属性,但是在选择色谱柱上面却无从下手。因为谱柱的种类千差万别,在USP(美国药典)中色谱柱分类从L1-L46,竟然有这么多,我究竟该选择哪一种色谱柱才更适合我呢?






色谱柱种类很多,而且每个厂家的色谱柱也不一样,有时候同样是C18的色谱柱,不同厂家的色谱柱之间也会有差别,我们要想选择合适的色谱柱,就需要对色谱柱的分类和内在性质有所了解,跟着麦哥(Max)一起梳理梳理吧。


液相色谱柱***常用的分类方法为按照用途划分,可以分为以下几类:


1.  反相柱RP(C18、C8、C4/C3)


2.  正相柱NP


3.  尺寸排阻柱(SEC)


4.  离子交换柱(IEX)


5.  亲水相互作用柱(HILIC)


我们下面针对这几种色谱柱逐一进行讲解:


一、反相柱(RP,Reversed Phase)


反相柱是实验室使用***广泛的色谱柱,它是以硅胶填料为基础,中间键合了极性相对较弱的官能团键合相,流动相一般为极性较强的有机相(甲醇、乙腈)。溶质按其疏水性大小进行分离,极性越大疏水性越小的溶质,越不易与非极性的固定相结合,所以先被洗脱下来。而极性较小疏水性较大的物质,就被保留下来,随着有机相比例增大,被依次洗脱下来。


反相柱也有很多亚类,按照碳链的长短可以分为C18、C8、C4/C3。我们常说的ODS就是C18色谱柱(Octadecylsilyl,十八烷基硅烷键合硅胶填料),这种色谱柱常用来分析化学小分子物质,在生物制药领域多用来进行氨基酸分析、多肽分析(<10KD),肽图分析等。


使用C18色谱柱需要注意的是,C18色谱柱能够耐受的pH值一般在3-8之间, 过低或者过高的pH值都会损坏色谱柱,造成硅胶溶解。有些C18色谱柱能够耐受的pH低至1,这些色谱柱往往是在C18硅胶填料的基础上进行了化学修饰形成的,值得一提的是Waters的BEH(亚乙级桥杂化技术),高pH条件下柱稳定性的强化测试结果表明柱寿命比超纯硅胶柱提高十倍以上,能够显著提高色谱柱的酸碱耐受性。此外,高盐溶液(>0.5M)也容易造成一定的硅胶填料溶解,所以盐溶液在分析过程中尽量要控制浓度,而且在与有机相进行混合的时候,比例要缓慢改变,否则容易造成盐的沉淀堵塞色谱柱。


上述pH与高盐溶液都是对色谱柱具有不可逆破坏的物质,此外还有一些物质也会对色谱柱造成影响,但是可以经过一定的方法进行清洗再生。一些添加剂会造成峰型改变,例如SDS、吐温、Triton等,可能造成柱压升高,需要多冲冲柱子才能解决。


此外,C18的色谱柱也尽量不要使用纯水相,否则可能造成疏水塌陷,影响色谱柱的保留特性。如果出现疏水塌陷,需要使用高比例有机相过夜冲洗,可以进行恢复。


C8和C4(有的厂家会出C3)色谱柱一般是针对大蛋白或者单抗的,碳链越短,对分子量较大的蛋白分析越有利。单抗一般选择C4色谱柱,抗原或者单抗亚基(LC&HC)可以选择C8色谱柱进行分析。值得一提的是分子量较大的蛋白在反相柱上都会有一定的残留,这时候我们需要采取一定的措施较少残留,不让残留在下一样品上形成鬼峰。一般采取的措施是每个样品之间走一个空白,并且提高色谱柱的柱温至70-80℃。流动相的pH对样品溶质的电离状态影响也很大,进而影响其疏水性,所以在分离肽类和蛋白质等生物大分子的过程中,经常要加入修饰性的离子对物质,***常用的离子对试剂是三氟乙酸(TFA),使用浓度为0.1%,使流动相的pH值为2~3,这样可以有效地抑制氨基酸上α羧基的离解,使其疏水性增加,延长洗脱时间,提高分辨率和分离效果。除此之外,还可以尝试磷酸、醋酸、甲酸。


二、正相柱(NP,Normal Phase)


正相柱与反相柱相似,也是以硅胶填料为基础,但是正相柱上键合的是极性相对较强的官能团键合相(如带有二醇基、氨基、和氰基的固定相及硅胶、三氧化二铝等),流动相一般为极性较弱的正己烷等物质。简单来说,如果采用固定相的极性大于流动相的极性,就称为正相色谱;如果固定相的极性小于流动相的极性,则称为反相色谱。


正相色谱一般用来分离中性化合物和离子化合物,主要以中性样品为主。正相色谱分析的样品有以下几种:异构体、族类分离、易水解样品、高脂溶性样品。我们所知的氨基柱和氰基柱(官能团为-CN氰基、-NH2氨基)在正相色谱上使用都很多。由于正相柱在生物制药领域使用不是很广泛,我们在这里就不详细说明了


三、尺寸排阻柱(SEC,Size Exclusion Column)


尺寸排阻色谱柱(SEC)是根据蛋白的分子量大小进行分离的一种色谱柱,采用的是多孔硅胶填料,分子量小的物质能够进入到硅胶孔内,走的路程多,分子量大的物质被排阻在硅胶孔外,走的路程少。于是分子量大的物质就先流出,分子量小的物质后流出,通过这种方法就可以将蛋白分离开了。


SEC色谱柱主要用于分析蛋白的聚集体状态,在生物制药领域蛋白质聚集体是需要严格控制的一个检项,因为聚集体很可能会产生免疫原性,造成药物的过敏反应。SEC可以很好的针对单抗,抗原等物质进行分析,分离出降解片段,单体,二聚体及多聚体。SEC色谱柱也有很多亚类,根据填料的孔径大小分类,可以分为1000A,300A和150A等几类。300A孔径的色谱柱经常用来分析单抗以及双特异性抗体,这类色谱柱的******分离范围在30kd-200kd之间。1000A的色谱柱填料孔径较大,适合分离大于200kd的大蛋白,以及一些ADC药物。而150A的色谱柱填料孔径较小,适合分离抗原或者多肽类药物,它的******分离范围在5kd-60kd之间。所以我们可以根据样品的分子量大小选择合适的色谱柱进行分离,值得一提的是SEC色谱柱基于它的特殊填料处理方式,似的硅胶颗粒基本不与蛋白发生相互作用,所以SEC色谱柱分离大蛋白不会产生蛋白残留,是一种理想的单抗分离手段。


SEC色谱柱一般使用缓冲盐作为流动相,常用的是PBS(磷酸盐缓冲液),相对于其他种类色谱柱,SEC色谱柱的寿命是比较短的。在SEC色谱柱使用久了以后会产生拖尾,或者峰展宽的情况,这时候我们可以对SEC色谱柱进行再生清洗。一般再生的方法有几种,可以根据需要结合起来使用:


1.    10%-20%甲醇低流速(正常流速的30%)冲洗15-20个CV(柱体积,column volume)


2.    0.25M Na2SO4或者NaCl冲洗5CV,纯水冲洗5CV,交替冲洗2次。


3.    5%异丙醇(IPA)冲洗5CV,冲洗过程中可以满环进样6M盐酸胍或者8M尿素,确保色谱柱上残留蛋白的变性。


以上方法冲洗可以对色谱柱进行再生,如果效果不是太好,可以尝试进行反冲,但是对于亚2微米的色谱柱,不可以进行反冲,否则填料就会流失。如果进行了反冲,建议以后色谱柱反着使用,因为反冲后的色谱柱整体结构有一定损坏,虽然暂时性能提升了,但是柱效的下降要比新柱子快很多,所以反冲尽量要慎重选择。


有时候峰型变差可能是由于蛋白引起的,我们换一个样品之后就好了,这是因为SEC色谱柱虽然是消除了蛋白与色谱柱的相互作用,但是现有技术无法做到100%消除这种作用,对于某些蛋白仍然是会有一定相互作用的。这时候我们在分析过程中可以添加精氨酸或者2%的IPA,或者加入150mM NaCl去减弱这种相互作用,可以改善峰型。


如果上述方法都没有效果,那么我们可能需要更换一根新的色谱柱了。在以后的分析过程中,我们可以增加一根保护柱(guard column)或者加上在线滤器(online filter),都可以有效延长SEC色谱柱的寿命。


四、离子交换柱(IEX,ion exchange)


离子交换色谱柱在硅胶基质的固定相上键合SO3-、COO-、NH3+等离子官能团,使固定相带上电荷。这种电荷与流动相中相反电荷的离子中和。当样品带有与固定相相反的电荷时,就被固定相抓取,随着流动相中相反电荷增加,与样品竞争性的和固定相结合,这样就把样品从固定相上取代下来,流出色谱柱。


离子交换柱按固定相电荷种类不同可以分为阳离子交换柱(CEX),阴离子交换柱(AEX)。其中阳离子交换柱固定相上键合阴离子基团,又分为强阳离子交换柱(SCX)和弱阳离子交换柱(WCX);阴离子交换柱固定相上键合阳离子基团,又分为强阴离子交换柱(SAX)和弱阴离子交换柱(WAX)。生物制药领域多使用弱阳离子交换柱(WCX),这是因为生物制药针对大蛋白,且蛋白的等电点一般在中性左右,故使用比蛋白等电点低1个单位的WCX更加合适。


WCX色谱柱主要用来进行电荷异构体的分析,根据不同的电荷异质性,我们可以得到相关的酸性峰,主峰和两个碱性峰。再结合质谱技术,我们可以发现2个碱性峰是单抗的末端赖氨酸(Lys)引起的,主峰是缺失两个Lys形成的,酸性峰是脱酰胺造成的。


WCX方法的优化可以使用盐梯度进行,也可以使用pH梯度进行,每家的仪器都有相关的离子交换方法开发软件,方便我们对离子交换的溶液配制以及梯度调整,这里不再一一说明。


五、亲水相互作用柱(HILIC,Hydrophilic Interaction column)


HILIC色谱柱是以硅胶基质,键合强亲水性的极性官能团,利用水相和有机相作为流动相的一类色谱柱。HILIC色谱柱的使用方式和反相RP色谱柱正好相反,初始是较高的有机相,然后不断的增加水相比例,将极性较强的物质依次洗脱下来。


HILIC色谱柱在生物制药领域主要用于糖基化(Glycosylation)的分析。糖基化是真核细胞(酵母、CHO)蛋白翻译后修饰(PTM)的重要方式,糖基化的差异可能直接导致细胞的ADCC(抗体介导的细胞毒作用)、CDC(补体介导的细胞毒作用),以及一些免疫过敏反应(非人源化唾液酸NGNA),所以HILIC色谱柱进行糖基化检测被广泛应用在生物制药领域。


常见的色谱柱就是这些啦,在生物制药领域主要使用RP、SEC、IEX、HILIC这几种色谱柱,大家把这几种色谱柱的主要使用环境牢记于心,在方法开发的时候就能够游刃有余,选择出适合自己分析的色谱柱了。


 
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